Principle of digitalMLPA
digitalMLPA 프로브
digitalMLPA 프로브믹스에는 특정 게놈 시퀀스를 대상으로 하는 프로브가 있습니다. digitalMLPA 프로브는 왼쪽 및 오른쪽 프로브 올리고뉴클레오티드 (LPO 및 RPO)의 두 부분으로 구성됩니다. LPO에는 P7 PCR 프라이머와 DNA 혼성화 시퀀스가 포함되어 있습니다. RPO에는 고유한 digitalMLPA read 식별을 위한 시퀀스와 DNA 혼성화 시퀀스가 포함되어 있습니다. 바코드 올리고 (BO)가 모든 반응에 추가됩니다. BO에는 Rd1 및 P5 프라이머 시퀀스와 함께 샘플 식별을 위한 고유 시퀀스가 포함되어 있습니다.
샘플 변성 및 프로브 혼성화
첫 번째 단계에서는 정제 된 샘플 DNA가 변성됩니다. 그 다음 digitalMLPA 프로브 올리고와 함께 하룻밤 동안 배양합니다. 각 프로브의 LPO 및 RPO는 바로 인접한 표적 DNA 시퀀스에 혼성화됩니다.
프로브 결찰
다음 단계는 바로 인접한 표적 시퀀스에 혼성화 된 프로브 올리고 간의 결찰입니다. 결찰 부위 주변에 불일치 (mismatch)가 있으면 결찰이 이루어지지 않으므로 결찰 반응은 매우 특이적입니다. 프로브 결찰 산물의 수는 샘플의 표적 시퀀스 수에 대한 척도입니다. digitalMLPA를 사용하면 결찰 이벤트 수를 감지할 수 있습니다.
프로브 증폭
결합된 프로브는 단일 P7/P5 프라이머 쌍을 사용하여 다중 PCR에서 증폭됩니다. 결찰된 프로브만 기하급수적으로 증폭되므로 결합되지 않은 프로브와 결찰되지 않은 프로브를 제거할 필요가 없습니다.
엠프리콘 시퀀싱
PCR 산물은 동일한 양으로 혼합되어 희석되고 변성된 후 Illumina 시퀀서에 로드됩니다. 모든 반응에서 각 프로브에 대해 신뢰할 수 있는 정량화를 위해 최소 400개의 단일 read가 생성되어야 합니다.
데이터 분석
마지막 단계는 Coffalyser digitalMLPA에 의한 데이터 분석입니다. Coffalyser digitalMLPA는 실험의 각 샘플에 대해 해석하기 쉬운 두 개의 보고서를 생성합니다. 하나는 일반적인 세부 정보가 포함된 보고서이고 다른 하나는 샘플 결과가 포함된 보고서입니다. 이 보고서는 샘플 및 반응 품질이 충분한지 여부를 표시하고 감지된 비정상 영역을 강조 표시합니다.
